环状RNA（circRNA）是一种新兴的内源性非编码RNA（ncRNA），它们参与细胞增殖、粘附、凋亡和存活等多个生物学过程[1]。
近年来，circRNAs在肿瘤领域也获得了越来越多的关注。有研究表明许多circRNA能促进细胞周期发展，抑制或诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制血管生成等等[2]，各种不同的circRNAs在肿瘤发生发展过程中起着不同甚至相反的作用。
虽然越来越多的研究报道了乳腺癌、肺癌和结直肠癌中异常的circRNAs[3]，但circRNAs在肿瘤细胞中的生物学功能、分子机制和环状模式尚不清楚。此外，还有研究提出circRNAs可以通过病理功能未知的外泌体分泌到循环中[4]，且比线性RNAs更容易被分选进入外泌体。然而，circRNAs的外泌体特异性分选机制也仍然完全未知。
近日，来自浙江大学张红河和中国药科大学来茂德领衔的研究团队，阐明了circRHOBTB3在结直肠癌（CRC）进展中的生物学作用、环化过程和分泌途径，这一结果发表在MolecularCancer期刊上。
他们发现，抑瘤circRHOBTB3通过外泌体被癌细胞排出，以维持结直肠癌细胞的活性。此外，他们还设计了靶向circRHOBTB3的环状化和分泌元件的反义寡核苷酸（ASOs），用于CRC的治疗。
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circRHOBTB3是宿主基因RHOBTB3转录后剪接和环状化而产生的一种circRNA。RHOBTB3作为RhoGTPase家族ATP酶，参与膜转运[5、6]和蛋白酶体降解[7]。
先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、卵巢癌、胃癌和肝细胞癌（HCC）中作为肿瘤抑制circRNA。然而，它的循环模式和外泌体分泌途径并未被阐释。
首先，研究人员分析了来自GEO数据库的12例CRC患者、21例HCC患者、32例胰腺腺癌（PAAD）患者和14例健康供体的血清外泌体的总RNA-seq数据。
结果显示，许多circRNAs在肿瘤患者血清外泌体中的表达程度不同（图1A），但在所有三种癌症来源的外泌体中，只有hsa_circ_0007444（circRHOBTB3）均表达上调（图1B），且其宿主基因RHOBTB3在三种肿瘤组织中的表达与正常组织相比均无显著性的增强（图1C）。
图1不同类型癌症中ircRHOBTB3在患者血清外泌体中的表达情况
然而，对来自浙江大学医学院邵逸夫医院体检的18例CRC患者和16例健康供者的血清样本数据分析发现，与健康供者相比，circRHOBTB3在CRC组织中显著下调，而宿主基因RHOBTB3显著上调（图2左二）。而且，在69个CRC组织样本中检测到的circRHOBTB3的表达结果显示，circRHOBTB3水平较高患者的总生存期更好（图2右一）。
图2 ircRHOBTB3在CRC组织中患者血清外泌体中的表达情况
于是，研究者不禁假设，circRHOBTB3是否具有抑癌作用？
为了验证这一点，他们先确定了CRC患者血清外泌体中的circRHOBTB3确实来源于肿瘤细胞而非基质细胞（图3A），且circRHOBTB3水平在来自NCM460细胞（正常的肠上皮细胞系）的外泌体中最低（图3B）。进一步在RKO、HCT116细胞（CRC细胞系）中过表达或敲低circRHOBTB3，结果表明circRHOBTB3可以抑制细胞迁移和侵袭能力（图3C）。
图3 circRHOBTB3来源与功能的体外验证实验
并且，他们通过对circRHOBTB3敲除/重新表达细胞系RNA-Seq数据的分析，以及RT-qPCR验证发现，在circRHOBTB3敲除的细胞系中代谢、增殖和上皮间充质转化（EMT）通路相关基因显著上调，而circRHOBTB3的重新表达降低了这些基因的表达。此外，circRHOBTB3敲除的细胞系中ROS水平也显著升高。
他们还发现circRHOBTB3的结合蛋白是ENO1和ENO2。也就是说，circRHOBTB3可能通过与ENO1和ENO2等代谢酶相互作用，调节细胞内ROS水平，抑制肿瘤细胞增殖和EMT。
为了验证circRHOBTB3在体内的功能，研究人员将过表达circRHOBTB3的HCT116细胞（CRC细胞系）皮下注射到裸鼠体内，构建了异种移植瘤模型。研究发现，与不表达circRHOBTB3的对照（EV）组相比，circRHOBTB3过表达（circRHOBTB3-OE）组的肿瘤体积和重量都显著更小，且细胞增殖能力也更弱（图4A、B、C）。
而当他们在裸鼠脾脏接种实验中观察肝转移表型时发现，circRHOBTB3-OE组肝转移灶少于EV组（图4D、E）。更为有趣的是，circRHOBTB3可以在异种移植瘤小鼠模型的血浆和尿液中检测到，而在野生型小鼠的血浆和尿液中则没有。此外，circRHOBTB3-OE组的血浆中circRHOBTB3的水平高于EV组（图4F、G）。
图4 circRHOBTB3功能的体内验证实验
根据这些数据，研究者们推测CRC细胞必须通过外泌体分泌抑制肿瘤的circRHOBTB3来维持肿瘤侵袭和转移的特征，换言之，CRC细胞有特殊的“排毒”机制。
在随后的研究中，研究人员发现了circRHOBTB3的环化机制，还发现circRHOBTB3本身的顺式元件（141–240nt，141-165nt，216-240nt）可以调节circRHOBTB3通过外泌体的分泌过程（图5）。
图5 转染了截断的circRHOBTB3载体的细胞中circRHOBTB3外泌体分泌丰度
之前已经有研究发现，ESCRT-II亚复合物作为一种RNA结合复合物，可以将RNA分选至外泌体[8]中。在该文研究中，他们发现SNF8可以结合到circRHOBTB3的141-240nt区域，促进circRHOBTB3被分选至外泌体并分泌到胞外。他们将这个过程被定义为“肿瘤外泌体逃逸机制”（图6）。
图6 SNF8敲低实验以及外源的RIP实验
受上述研究结果启发，研究人员设计了二代ASOs，以增加circRHOBTB3的环化并减少分泌，这有望成为一种新的癌症治疗策略。
研究人员设计了三种二代ASOs：一个靶向负环化的元件（ASO-cir：266-290nt）和两个外泌体分泌的元件（ASO-exo1：141-165nt，ASO-exo2：216-240nt）（图7）。
通过实验他们发现，ASO-cir确实能增加circRHOBTB3的环化，但circRHOBTB3的分泌却会同时增加；而ASO-exo1和ASO-exo2中，仅ASO-exo2（以下简称ASO-exo）既增加circRHOBTB3的胞内水平，又阻断circRHOBTB3外泌体的分泌。因此，研究者们考虑进一步使用ASO-cir和ASO-exo，研究二者联合治疗对结直肠癌的特异性和抗肿瘤效果。
图7二代ASOs及其作用机制
研究人员验证了ASOs的联合用药的确比ASO-cir和ASO-exo的单独用药能产生更多的胞内circRHOBTB3，且小鼠实验的结果符合预期：ASO-cir联合ASO-exo确实显著提高了脾脏原发病灶中circRHOBTB3的表达，还可显著减少肿瘤恶病质，且能控制转移（图8）。
图8 ASOs体外及体内实验
总的来说，这项研究成果阐明了circRHOBTB3调节细胞间ROS和代谢途径来抑制CRC的进展的机制，还且提出了一种新的肿瘤逃逸理论，即肿瘤细胞通过“排泄”肿瘤抑制circRNA来维持癌细胞的活性（“肿瘤外泌体逃逸机制”）。
更重要的是，他们设计的二代ASOs可以通过靶向环化和分泌来调控肿瘤抑制circRNA，以此促进癌症的治疗效果。且他们的临床数据显示，在CRC患者中，85.7%（30/35）的肿瘤样本携带的circRHOBTB3水平低于配对的正常样本，而肿瘤样本中circRHOBTB3的低表达与较差的预后相关。这让我们更加相信，这种ASOs将成为未来针对CRC的一种有前途的治疗策略。
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